單克隆抗體的制備過程兩次篩選的方法？
日期：2026-01-14 09:59:57
單克隆抗體制備過程中的兩次篩選，目的和方法完全不同，核心是為了篩選出能穩(wěn)定分泌目標特異性抗體的雜交瘤細胞，具體如下：
2、篩選方法：HAT培養(yǎng)基篩選法
2、常用篩選方法
第一次篩選：篩選雜交瘤細胞（去除未融合細胞和自身融合細胞）
1、篩選目的
細胞融合后，體系中會存在三種細胞：未融合的脾B淋巴細胞、未融合的骨髓瘤細胞、脾B細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交瘤細胞。
其中未融合的脾B細胞會在體外短期培養(yǎng)后死亡，而未融合的骨髓瘤細胞會持續(xù)增殖，干擾雜交瘤細胞的篩選。因此第一次篩選的核心是淘汰未融合的骨髓瘤細胞，保留雜交瘤細胞。
2、篩選方法：HAT培養(yǎng)基篩選法
采用次黃嘌呤（H）-氨基蝶呤（A）-胸腺嘧啶核苷（T）選擇性培養(yǎng)基進行篩選。
原理：細胞合成DNA有兩條途徑，即從頭合成途徑和補救合成途徑。氨基蝶呤（A）能阻斷從頭合成途徑；骨髓瘤細胞通常是HGPRT?（次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷）或TK?（胸苷激酶缺陷）株，無法進行補救合成途徑，在HAT培養(yǎng)基中會因無法合成DNA而死亡。
脾B細胞本身有HGPRT和TK，能利用補救途徑合成DNA，但它在體外不能無限增殖，培養(yǎng)一段時間后會自然凋亡。
只有融合的雜交瘤細胞，既繼承了脾B細胞的HGPRT/TK活性（可利用補救途徑合成DNA），又繼承了骨髓瘤細胞無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活并增殖。
第二次篩選：篩選能分泌特異性抗體的雜交瘤細胞
1、篩選目的
第一次篩選存活的雜交瘤細胞，是來自不同脾B細胞與骨髓瘤細胞的融合體，而這些脾B細胞中，只有少數能分泌針對目標抗原的抗體，其余分泌的是無關抗體。因此第二次篩選的核心是篩選出僅分泌目標特異性抗體的陽性雜交瘤細胞。
2、常用篩選方法
方法多樣，核心是抗原-抗體特異性結合反應，常用的有以下幾種：
酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：最常用的方法。將目標抗原包被在酶標板上，加入待篩選的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液，若上清液中有目標特異性抗體，就會與包被的抗原結合；再加入酶標記的二抗，通過酶催化底物顯色，根據顯色深淺判斷是否為陽性雜交瘤細胞。
間接血凝試驗：將目標抗原偶聯(lián)到紅細胞表面，若雜交瘤細胞上清液中有特異性抗體，會使紅細胞發(fā)生凝集，以此判斷陽性克隆。
免疫熒光試驗：將目標抗原固定在細胞或玻片上，加入雜交瘤細胞上清液，再加入熒光標記二抗，通過熒光顯微鏡觀察是否有熒光信號，篩選陽性細胞。
經過這兩次篩選后，得到的陽性雜交瘤細胞可進行克隆化培養(yǎng)（如有限稀釋法、軟瓊脂法），最終獲得能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細胞株。
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