CD3抗體和CD28抗體活化T細(xì)胞流式樣本制備

日期：2026-03-04 13:48:02

進(jìn)行功能級(jí)CD3和CD28抗體活化T細(xì)胞并制備流式細(xì)胞術(shù)樣本，關(guān)鍵在于模擬生理?xiàng)l件下的T細(xì)胞受體（TCR）共刺激信號(hào)，并在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)捕獲激活標(biāo)志物或胞內(nèi)因子。

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備與試劑配制

需要準(zhǔn)備好無(wú)菌的完全培養(yǎng)基（如RPMI 1640，添加10%胎牛血清FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗、以及必要的HEPES緩沖液）。對(duì)于功能級(jí)抗體，通常推薦使用可溶性抗體配合交聯(lián)劑，或者使用包被抗體的方法。若追求最強(qiáng)的生理模擬且操作簡(jiǎn)便，許多實(shí)驗(yàn)室傾向于使用可溶性抗體聯(lián)合二抗交聯(lián)，或直接使用預(yù)混合的功能級(jí)激活復(fù)合物。但為了經(jīng)典的流式樣本制備邏輯，這里介紹可溶性抗體聯(lián)合交聯(lián)或平板包被兩種常見策略中的可溶性交聯(lián)法（更適合懸浮細(xì)胞均一活化），以及后續(xù)的刺激阻斷步驟。準(zhǔn)備以下關(guān)鍵試劑：

純化的抗人CD3抗體（功能級(jí)，如OKT3克?。?/span>

純化的抗人CD28抗體（功能級(jí)，如CD28.2克?。?。

如果使用的是未偶聯(lián)的一抗，需準(zhǔn)備山羊抗小鼠IgG二抗（用于交聯(lián)）；如果購(gòu)買的是預(yù)偶聯(lián)或?qū)Ｓ眉せ钗⒅閯t按說明書操作，但此處假設(shè)使用經(jīng)典的可溶性抗體方案。

蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑： Brefeldin A (BFA) 或 Monensin。這是檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子（如IFN-γ, IL-2, TNF-α）的關(guān)鍵，必須在刺激后期加入。

流式染色緩沖液（含2% FBS的PBS）、紅細(xì)胞裂解液（若使用全血）、固定破膜試劑盒。

表面標(biāo)志物抗體（如CD3, CD4, CD8, CD25, CD69）和胞內(nèi)因子抗體。

二、T細(xì)胞分離與重懸

使用的是外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），需先通過密度梯度離心法從全血中分離PBMC。洗滌細(xì)胞后，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度。如果是純化的T細(xì)胞，直接重懸即可。

將細(xì)胞重懸于預(yù)熱至37℃的完全培養(yǎng)基中。建議起始細(xì)胞密度為每毫升100萬(wàn)到200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞（1-2 × 10^6 cells/mL）。過高的密度可能導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)耗盡或細(xì)胞聚集，影響活化效率；過低則可能導(dǎo)致旁分泌信號(hào)不足。將細(xì)胞分裝至無(wú)菌的培養(yǎng)板（如96孔U底板或24孔板）中，每孔體積根據(jù)后續(xù)操作便利性決定，通常為200μL至1mL。

三、抗體活化刺激流程

這是實(shí)驗(yàn)的核心步驟。將抗CD3抗體和抗CD28抗體加入到細(xì)胞懸液中。抗體濃度設(shè)定：

通?？笴D3抗體的終濃度范圍為0.5 μg/mL 至 5 μg/mL，抗CD28抗體的終濃度范圍為0.5 μg/mL 至 2 μg/mL。具體的最佳濃度可能因抗體克隆號(hào)和批次而異，建議初次實(shí)驗(yàn)參考抗體說明書，常用組合是CD3 (1 μg/mL) + CD28 (1 μg/mL)。交聯(lián)步驟（關(guān)鍵）：

如果使用的是未偶聯(lián)的可溶性抗體，單獨(dú)加入往往不足以產(chǎn)生強(qiáng)烈的活化信號(hào)，因?yàn)門CR需要聚集。此時(shí)需要加入二抗（如F(ab')2片段的山羊抗小鼠IgG）進(jìn)行交聯(lián)，二抗的濃度通常是一抗總濃度的1/2到等量。另一種方法是直接使用預(yù)先混合好的功能級(jí)抗體對(duì)，或者使用磁珠/微珠系統(tǒng)。若采用平板包被法，則需提前一晚用抗體包被培養(yǎng)板，洗滌后再加入細(xì)胞，此時(shí)無(wú)需額外加可溶性抗體和二抗。刺激時(shí)間控制：

早期激活標(biāo)志物檢測(cè)（如CD69）：刺激后培養(yǎng)4至6小時(shí)即可檢測(cè)。

增殖標(biāo)志物檢測(cè)（如CD25）：通常需要刺激24至48小時(shí)。

胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)（如IFN-γ, IL-2）：這是最常見的功能級(jí)檢測(cè)。總刺激時(shí)間通常為4至6小時(shí)，或者先刺激一段時(shí)間再加入抑制劑。

蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的加入：為了在細(xì)胞內(nèi)積累細(xì)胞因子以便流式檢測(cè)，必須在刺激過程中加入Brefeldin A (BFA) 或 Monensin。

方案A（短程刺激）：在加入CD3/CD28抗體的同時(shí)（或抗體加入后1小時(shí)內(nèi)）立即加入BFA/Monensin，總共培養(yǎng)4-6小時(shí)。這種方法背景較低，適合檢測(cè)強(qiáng)效應(yīng)答。

方案B（長(zhǎng)程預(yù)刺激）：先用CD3/CD28抗體刺激細(xì)胞2-4小時(shí)，讓T細(xì)胞充分啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，然后再加入BFA/Monensin，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)（總時(shí)長(zhǎng)6-10小時(shí)）。這種方法通常能獲得更高的細(xì)胞因子陽(yáng)性率。

抑制劑不能加入過早（影響細(xì)胞活化啟動(dòng)）也不能過晚（細(xì)胞因子已分泌到胞外），且作用時(shí)間不宜超過12小時(shí)，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性。

四、流式樣本制備與染色

刺激結(jié)束后，開始制備流式樣本。

1. 細(xì)胞收集與洗滌

將細(xì)胞從培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至流式管中。如果是貼壁或半貼壁狀態(tài)（雖T細(xì)胞主要懸浮，但活化后可能有輕微聚集），需用移液槍輕輕吹打混勻。用冷的流式染色緩沖液（PBS + 2% FBS）洗滌細(xì)胞一次，離心（300-400g，5分鐘），棄上清。

2. 表面抗原染色

用適量染色緩沖液重懸細(xì)胞沉淀。加入針對(duì)表面標(biāo)志物的抗體組合（例如：Anti-CD3-FITC, Anti-CD4-APC, Anti-CD8-PE-Cy7, Anti-CD25-PE等）。

CD3抗體用于圈門T細(xì)胞，但如果你的刺激抗體也是抗CD3且未洗脫，可能會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)。通常刺激用的CD3抗體與流式檢測(cè)用的CD3抗體克隆不同，或者在染色前通過充分洗滌減少干擾。更穩(wěn)妥的做法是使用針對(duì)不同表位的克隆，或者在刺激后充分洗滌。

避光孵育：在4℃冰箱中避光孵育20-30分鐘。

3. 洗滌與固定

孵育結(jié)束后，加入染色緩沖液洗滌細(xì)胞，離心棄上清，去除未結(jié)合的表面抗體。

接下來(lái)進(jìn)行固定。加入固定液（通常是含多聚甲醛的緩沖液），重懸細(xì)胞，室溫或4℃避光孵育15-20分鐘。固定能保持細(xì)胞形態(tài)并滅活潛在病原體。

4. 破膜與胞內(nèi)染色

固定完成后，離心棄去固定液。加入破膜緩沖液（Permeabilization Buffer，通常含皂苷成分），重懸細(xì)胞。這一步是為了讓抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。

在破膜緩沖液存在的情況下，加入胞內(nèi)因子抗體（例如：Anti-IFN-γ-APC-Cy7, Anti-IL-2-BV421, Anti-TNF-α-PE）。

關(guān)鍵點(diǎn)：胞內(nèi)抗體的稀釋和孵育必須在破膜緩沖液中進(jìn)行，一旦換回普通PBS，膜孔閉合，抗體將無(wú)法進(jìn)入。

避光孵育：室溫或4℃避光孵育30-45分鐘。

5. 最終洗滌與上機(jī)

孵育結(jié)束后，再次用破膜緩沖液或染色緩沖液洗滌細(xì)胞（視試劑盒說明書而定，通常建議用破膜液洗一次，再用普通緩沖液洗一次以去除殘留皂苷），離心棄上清。

用200-300μL的流式染色緩沖液重懸細(xì)胞沉淀。如果樣品不能立即上機(jī)，可置于4℃避光保存，但建議在當(dāng)天完成檢測(cè)以保證熒光信號(hào)穩(wěn)定。

五、數(shù)據(jù)分析策略簡(jiǎn)述

上機(jī)采集數(shù)據(jù)后，分析邏輯如下：

首先利用FSC/SSC圈出淋巴細(xì)胞群，排除碎片和死細(xì)胞（如有死活染料）。

接著，利用CD3陽(yáng)性細(xì)胞圈出T細(xì)胞總體。

在CD3+群體中，區(qū)分CD4+和CD8+亞群。

在CD4+或CD8+門內(nèi)，觀察CD69（早期激活）、CD25（持續(xù)激活）的表達(dá)水平，以及IFN-γ、IL-2、TNF-α等細(xì)胞因子的陽(yáng)性比例和平均熒光強(qiáng)度（MFI）。

未加抗體刺激的陰性對(duì)照組應(yīng)顯示極低的細(xì)胞因子背景，而陽(yáng)性對(duì)照（如PMA+Ionomycin刺激）應(yīng)顯示極高的陽(yáng)性率，以此驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的有效性。

六、注意事項(xiàng)

無(wú)菌操作：整個(gè)活化過程涉及數(shù)小時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)，必須嚴(yán)格無(wú)菌，防止細(xì)菌污染導(dǎo)致假陽(yáng)性或細(xì)胞死亡。

抗體滴度優(yōu)化：不同來(lái)源的T細(xì)胞（健康人vs病人）對(duì)抗體濃度的敏感性不同，正式實(shí)驗(yàn)前最好進(jìn)行濃度梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)。

對(duì)照設(shè)置：務(wù)必設(shè)置“未刺激組”（僅加培養(yǎng)基或同型對(duì)照抗體）作為陰性對(duì)照，以扣除自發(fā)分泌的背景；如有條件，設(shè)置PMA/Ionomycin刺激組作為陽(yáng)性對(duì)照，以確認(rèn)細(xì)胞具備分泌能力。

時(shí)間把控：BFA/Monensin的處理時(shí)間非常敏感，時(shí)間過短信號(hào)弱，時(shí)間過長(zhǎng)細(xì)胞狀態(tài)差，需嚴(yán)格計(jì)時(shí)。

熒光補(bǔ)償：由于活化后細(xì)胞體積變大、顆粒度改變，且某些激活標(biāo)志物表達(dá)量極高，容易引起熒光溢漏，上機(jī)前必須做好單染補(bǔ)償對(duì)照。