抗體表達(dá)量檢測(cè)方法有哪幾種?
日期：2026-02-06 15:37:17
抗體表達(dá)量的檢測(cè)方法可根據(jù)檢測(cè)層面（細(xì)胞內(nèi) / 上清液）、檢測(cè)原理（免疫結(jié)合 / 理化分析 / 生物學(xué)活性）和檢測(cè)通量（定性 / 定量、低通量 / 高通量）分類，核心分為直接定量法、免疫結(jié)合法、生物學(xué)活性法三大類，還有適配不同研究階段的輔助檢測(cè)方法，不同方法的靈敏度、操作難度、適用場(chǎng)景差異顯著，以下是主流方法的詳細(xì)梳理，含原理、優(yōu)勢(shì)、局限性和適用場(chǎng)景：
（2）夾心 ELISA
（2）免疫比濁法
3、滴度測(cè)定（如雜交瘤腹水滴度）
一、直接理化定量法（測(cè)總蛋白量，無(wú)特異性）
直接檢測(cè)樣品中總蛋白濃度，若樣品為高純度抗體（如純化后的單抗），可直接代表抗體表達(dá)量，是純化后抗體定量的金標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法區(qū)分抗體與雜蛋白。
1、紫外吸收法（A280 法）
原理：抗體的色氨酸、酪氨酸在 280nm 處有特征紫外吸收，根據(jù)吸光度值結(jié)合公式計(jì)算濃度（IgG：1 A280≈1.43 mg/mL，可根據(jù)抗體亞型調(diào)整系數(shù)）。
優(yōu)勢(shì)：快速、無(wú)損、無(wú)需試劑，可直接檢測(cè)上清 / 純化樣品，適合快速初篩。
局限：樣品純度需＞90%，低純度樣品（如細(xì)胞裂解液）易受雜蛋白干擾。
適用：純化后抗體的快速定量、發(fā)酵上清的粗定量。
2、BCA 法 / 考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）
原理：利用蛋白與染料的顯色反應(yīng)，吸光度與蛋白濃度成正比，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。
優(yōu)勢(shì)：靈敏度高（BCA：μg/mL 級(jí)，Bradford：ng/mL 級(jí)），操作簡(jiǎn)單，適合低濃度樣品。
局限：無(wú)特異性，需樣品初步純化；Bradford 法受去污劑干擾大。
適用：細(xì)胞裂解液中總抗體的粗定量、純化抗體的精準(zhǔn)定量（補(bǔ)充A280法）。
二、免疫結(jié)合定量法（測(cè)特異性抗體）
利用抗原 - 抗體的特異性結(jié)合，通過(guò)標(biāo)記物（酶、熒光、同位素）放大信號(hào)，定量檢測(cè)樣品中的特異性抗體，可區(qū)分目標(biāo)抗體與雜蛋白，是未純化樣品（細(xì)胞上清 / 裂解液）抗體表達(dá)量檢測(cè)的主流方法，靈敏度覆蓋 ng/mL~pg/mL 級(jí)。
1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）—— 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)定量首選
（1）間接ELISA
原理：包被抗原→結(jié)合樣品中的目標(biāo)抗體→加酶標(biāo)二抗（抗抗體）→加底物顯色，吸光度與抗體濃度成正比。
優(yōu)勢(shì)：特異性高、靈敏度高（ng/mL 級(jí)）、操作簡(jiǎn)單、通量高（96/384 孔板）、成本低。
局限：需純化抗原，無(wú)法區(qū)分抗體的構(gòu)象（折疊正確 / 錯(cuò)誤）。
適用：細(xì)胞培養(yǎng)上清、雜交瘤腹水、血清中特異性抗體的常規(guī)定量，高通量篩選高表達(dá)株。
（2）夾心 ELISA
原理：包被捕獲抗體（抗抗體恒定區(qū)，如抗 IgG Fc 段）→結(jié)合樣品中的目標(biāo)抗體→加酶標(biāo)檢測(cè)抗原→顯色定量，無(wú)需目標(biāo)抗體的特異性抗原。
優(yōu)勢(shì)：無(wú)需純化的特異性抗原，僅需抗 Fc 段抗體，適合抗原難以純化的抗體定量。
局限：靈敏度略低于間接 ELISA，需匹配抗體亞型的捕獲 / 檢測(cè)試劑。
適用：新型抗體（如雙抗、融合抗體）、抗原難制備的抗體的定量。
2、免疫印跡法（WB/Western Blot）—— 定性 + 半定量
原理：樣品經(jīng) SDS-PAGE 分離→轉(zhuǎn)膜→加一抗（抗目標(biāo)抗體）/ 二抗（酶標(biāo)）→顯色，通過(guò)條帶灰度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比實(shí)現(xiàn)半定量。
優(yōu)勢(shì)：可同時(shí)驗(yàn)證抗體的分子量和表達(dá)量，排除雜蛋白干擾，適合確認(rèn)抗體是否正確表達(dá)。
局限：半定量（精度低于 ELISA）、通量低、操作繁瑣。
適用：抗體表達(dá)的定性驗(yàn)證、低通量樣品的半定量、排查抗體降解 / 錯(cuò)配問(wèn)題。
3、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）—— 細(xì)胞表面抗體 / 胞內(nèi)抗體的原位定量
原理：對(duì)表達(dá)抗體的細(xì)胞（如雜交瘤、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞）進(jìn)行熒光標(biāo)記（抗抗體熒光二抗），通過(guò)流式檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，熒光值與細(xì)胞內(nèi) / 表面的抗體表達(dá)量成正比，可單細(xì)水平定量。
優(yōu)勢(shì)：原位檢測(cè)、單細(xì)分辨率、可同時(shí)分析細(xì)胞活率 / 表型，適合細(xì)胞株篩選。
局限：需制備單細(xì)胞懸液，無(wú)法檢測(cè)上清中的分泌型抗體。
適用：雜交瘤細(xì)胞、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的高表達(dá)株高通量篩選，細(xì)胞表面抗體（如抗體藥物偶聯(lián)物 ADC）的表達(dá)定量。
4、其他免疫定量法
（1）化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）
原理：與 ELISA 類似，以化學(xué)發(fā)光底物替代酶促顯色，信號(hào)更強(qiáng)、靈敏度更高（pg/mL 級(jí)）。
適用：低濃度抗體樣品（如微量上清、血清）的超敏定量，臨床樣本檢測(cè)。
（2）免疫比濁法
原理：抗體與抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，使溶液濁度增加，濁度與抗體濃度成正比。
優(yōu)勢(shì)：快速、自動(dòng)化程度高，適合大批量樣品檢測(cè)。
適用：臨床血清中抗體的常規(guī)檢測(cè)，工業(yè)大規(guī)模發(fā)酵的快速質(zhì)控。
三、生物學(xué)活性法（測(cè)功能活性抗體，最貼合實(shí)際應(yīng)用）
抗體的核心價(jià)值是生物學(xué)活性（如中和抗原、結(jié)合受體、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性 ADCC 等），該類方法通過(guò)檢測(cè)抗體的功能活性間接定量，反映的是折疊正確、具有生物活性的抗體含量，而非總抗體量，是抗體藥物研發(fā)的關(guān)鍵檢測(cè)方法（僅活性抗體有藥用價(jià)值）。
（1）中和試驗(yàn)
原理：抗體與病毒 / 毒素 / 細(xì)胞因子結(jié)合，抑制其生物活性，通過(guò)檢測(cè)靶細(xì)胞的存活 / 病變程度，定量中和活性抗體的濃度（如 ED50、IC50）。
優(yōu)勢(shì)：直接反映抗體的核心功能，貼合臨床應(yīng)用。
局限：操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、通量低，需活細(xì)胞 / 病毒模型。
適用：中和抗體（如抗病毒、抗毒素抗體）的活性定量與篩選。
（2）結(jié)合活性試驗(yàn)（SPR/BLI）
原理：利用表面等離子體共振（SPR）/生物層干涉技術(shù)（BLI），實(shí)時(shí)檢測(cè)抗體與抗原的結(jié)合動(dòng)力學(xué)（Ka、Kd、KD），同時(shí)可通過(guò)結(jié)合信號(hào)定量抗體濃度。
優(yōu)勢(shì)：無(wú)標(biāo)記、實(shí)時(shí)檢測(cè)、可同時(shí)測(cè)結(jié)合活性和表達(dá)量，精準(zhǔn)反映抗體的構(gòu)象完整性。
局限：儀器昂貴（SPR：百萬(wàn)級(jí)）、操作要求高，適合少量樣品的精準(zhǔn)分析。
適用：抗體藥物的活性質(zhì)控、高親和力抗體的篩選、結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究。
（3）細(xì)胞介導(dǎo)的活性試驗(yàn)（ADCC/CDC 試驗(yàn)）
原理：檢測(cè)抗體介導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞毒性（ADCC）/補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性（CDC），通過(guò)靶細(xì)胞的裂解程度定量活性抗體。
優(yōu)勢(shì)：直接反映抗體的效應(yīng)功能，貼合抗體藥物的體內(nèi)作用機(jī)制。
局限：操作復(fù)雜、重復(fù)性要求高，需效應(yīng)細(xì)胞 / 補(bǔ)體。
適用：抗腫瘤、抗免疫性疾病抗體藥物的活性定量。
四、輔助檢測(cè)方法（適配抗體表達(dá)的初篩 / 高通量篩選）
這類方法以定性 / 半定量為主，快速、低成本，適合抗體表達(dá)的初步篩選，快速淘汰低表達(dá)株，減少后續(xù)定量工作的工作量。
1、免疫熒光染色（IF/ICC）
原理：對(duì)表達(dá)抗體的細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過(guò)熒光顯微鏡 / 共聚焦觀察熒光強(qiáng)度，半定量判斷抗體表達(dá)量。
適用：細(xì)胞內(nèi)抗體表達(dá)的初篩，快速判斷細(xì)胞是否表達(dá)目標(biāo)抗體。
2、斑點(diǎn)雜交（Dot Blot）
原理：將樣品直接點(diǎn)在膜上，無(wú)需電泳，通過(guò)免疫結(jié)合顯色，半定量判斷抗體表達(dá)量。
優(yōu)勢(shì)：比 WB 更快速、通量更高，適合大量樣品的初篩。
適用：雜交瘤細(xì)胞上清、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞上清的高通量初篩。
3、滴度測(cè)定（如雜交瘤腹水滴度）
原理：將樣品倍比稀釋，通過(guò) ELISA / 中和試驗(yàn)檢測(cè)最高陽(yáng)性稀釋度，反映抗體的相對(duì)表達(dá)量。
優(yōu)勢(shì)：快速、低成本，適合初步評(píng)估表達(dá)水平。
適用：雜交瘤細(xì)胞的初篩，快速判斷高滴度株。
五、不同研究階段的方法選擇指南
| 研究階段 | 檢測(cè)目標(biāo) | 首選方法 | 輔助方法 |
| 抗體表達(dá)初篩 | 快速判斷是否表達(dá) / 低通量 | 免疫熒光、Dot Blot、WB | 紫外吸收法（粗定量） |
| 高表達(dá)株篩選 | 高通量、特異性定量 | ELISA、流式細(xì)胞術(shù) | 滴度測(cè)定 |
| 純化后抗體定量 | 精準(zhǔn)、無(wú)損總蛋白定量 | 紫外吸收法（A280）+BCA | 免疫比濁法 |
| 抗體活性驗(yàn)證 | 功能活性抗體定量 | ELISA（結(jié)合活性）+SPR | 中和試驗(yàn)、ADCC/CDC 試驗(yàn) |
| 臨床 / 工業(yè)質(zhì)控 | 超敏、精準(zhǔn)、自動(dòng)化 | CLIA、免疫比濁法、SPR | BCA 法（補(bǔ)充） |
六、核心方法對(duì)比（靈敏度 + 特異性 + 操作難度）
| 方法 | 靈敏度 | 特異性 | 操作難度 | 定量類型 |
| 紫外吸收法 | mg/mL級(jí) | 無(wú) | 易 | 絕對(duì)定量 |
| ELISA | ng/mL級(jí) | 高 | 中 | 絕對(duì)定量 |
| CLIA | pg/mL級(jí) | 高 | 中 | 絕對(duì)定量 |
| 流式細(xì)胞術(shù) | 單細(xì)水平 | 高 | 中 | 相對(duì)定量 |
| WB | ng/mL級(jí) | 高 | 難 | 半定量 |
| SPR/BLI | ng/mL級(jí) | 高 | 難 | 絕對(duì)定量 |
| 中和試驗(yàn) | 活性單位 | 極高 | 極難 | 相對(duì)定量 |
