胞內(nèi)抗原的流式抗體，與針對膜表面抗原的流式抗體相比，在實驗操作上有哪些特殊要求？

日期：2025-12-30 11:42:47

針對胞內(nèi)抗原的流式抗體檢測，相比膜表面抗原檢測，核心差異在于需要對細(xì)胞進(jìn)行通透化處理，同時在樣本制備、固定、染色順序等環(huán)節(jié)也有特殊要求，具體如下：

1、必須增加固定與通透化步驟

膜表面抗原位于細(xì)胞膜外側(cè)，抗體可直接結(jié)合，無需破壞細(xì)胞膜；而胞內(nèi)抗原（細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等）存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，必須先通過固定和通透化打開細(xì)胞膜通道，才能讓抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部結(jié)合靶抗原。

固定常用甲醛、多聚甲醛等試劑，作用是維持細(xì)胞形態(tài)、防止抗原降解，并使細(xì)胞膜蛋白交聯(lián)；通透化則常用TritonX-100、皂素（Saponin）等試劑，其中TritonX-100可破壞細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層形成小孔，適用于核內(nèi)抗原（如轉(zhuǎn)錄因子）檢測，皂素僅溶解細(xì)胞膜上的膽固醇形成可逆小孔，更適合胞質(zhì)抗原（如細(xì)胞因子）檢測，且對細(xì)胞形態(tài)影響較小。

2、染色順序有嚴(yán)格要求

膜表面抗原檢測可直接對新鮮細(xì)胞進(jìn)行抗體染色；而胞內(nèi)抗原檢測的染色順序需區(qū)分直接法和間接法，同時若需聯(lián)合檢測膜表面抗原，需遵循“先膜后胞內(nèi)”的原則。

具體來說，先對新鮮細(xì)胞進(jìn)行膜表面抗原的染色，之后再進(jìn)行固定和通透化，最后加入胞內(nèi)抗體進(jìn)行染色。這是因為固定和通透化會破壞膜表面抗原的構(gòu)象，導(dǎo)致膜抗原抗體無法有效結(jié)合。

3、對抗體制備和選擇要求更高

胞內(nèi)抗體需要能耐受固定劑的處理，且其抗原結(jié)合位點不能被固定過程中蛋白的交聯(lián)作用掩蓋，因此通常需要選擇經(jīng)驗證適用于胞內(nèi)染色的抗體；而膜表面抗體一般無需考慮固定劑的影響。

另外，胞內(nèi)染色背景更容易偏高，常需要設(shè)置更嚴(yán)格的對照（如同型對照、陰性對照），且抗體的孵育時間和濃度需要更精細(xì)的優(yōu)化。

4、樣本處理過程需更注意抗原穩(wěn)定性

胞內(nèi)抗原（尤其是細(xì)胞因子）的表達(dá)易受外界刺激影響，若檢測的是誘導(dǎo)性表達(dá)的細(xì)胞因子，需要在體外刺激細(xì)胞的同時加入蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑（如莫能菌素、布雷菲德菌素A），阻止新合成的細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，使其在胞內(nèi)累積，從而提高檢測靈敏度。

而膜表面抗原檢測一般無需添加此類抑制劑，僅需維持細(xì)胞的活性和正常狀態(tài)即可。

5、洗滌和孵育條件更嚴(yán)格

通透化后的細(xì)胞更容易破碎，因此在洗滌步驟中需要使用溫和的緩沖液（如含皂素的PBS），且離心速度和時間需適當(dāng)降低，避免細(xì)胞損失；

胞內(nèi)抗體孵育時，緩沖液中通常需要加入通透劑（如皂素），維持細(xì)胞膜的通透狀態(tài)，確?？贵w能持續(xù)進(jìn)入細(xì)胞，而膜表面抗體孵育僅需普通的染色緩沖液即可。