單克隆抗體制備中，雜交瘤細(xì)胞株的篩選策略是什么？如何保證篩選出的陽(yáng)性克隆具有穩(wěn)定的抗體分泌能力？
日期：2025-12-19 13:40:57
單克隆抗體制備中，雜交瘤細(xì)胞株的篩選核心是分兩步篩除無(wú)關(guān)細(xì)胞（未融合的脾細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞），并驗(yàn)證目標(biāo)抗體的特異性與分泌穩(wěn)定性，整體策略分為初篩和復(fù)篩兩個(gè)階段，同時(shí)結(jié)合亞克隆和穩(wěn)定性傳代驗(yàn)證來(lái)保障陽(yáng)性克隆的抗體分泌能力。
一、雜交瘤細(xì)胞株的篩選策略（初篩+復(fù)篩）
二、保證陽(yáng)性克隆具有穩(wěn)定抗體分泌能力的關(guān)鍵措施
一、雜交瘤細(xì)胞株的篩選策略（初篩+復(fù)篩）
雜交瘤細(xì)胞融合后，體系中會(huì)存在3類(lèi)細(xì)胞：未融合的脾細(xì)胞（會(huì)自行凋亡）、未融合的骨髓瘤細(xì)胞、融合成功的雜交瘤細(xì)胞。篩選的核心是先淘汰骨髓瘤細(xì)胞，再篩選出能分泌目標(biāo)抗體的雜交瘤細(xì)胞。
1.第一步：選擇性培養(yǎng)基篩選（淘汰骨髓瘤細(xì)胞，初篩的基礎(chǔ)）
融合后的細(xì)胞懸液會(huì)被接種到HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，原理是利用嘌呤和嘧啶的合成通路差異實(shí)現(xiàn)篩選：
正常細(xì)胞（脾細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞）可通過(guò)補(bǔ)救途徑利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T）合成核酸，維持生長(zhǎng)。
用于融合的骨髓瘤細(xì)胞是HGPRT?（次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型）或TK?（胸苷激酶缺陷型）細(xì)胞，無(wú)法利用補(bǔ)救途徑合成核酸；同時(shí)HAT培養(yǎng)基中的氨基蝶呤（A）會(huì)阻斷核酸合成的從頭途徑。
最終結(jié)果：未融合的骨髓瘤細(xì)胞因無(wú)法合成核酸而死亡；未融合的脾細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下只能存活1~2周；只有融合成功的雜交瘤細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基中持續(xù)生長(zhǎng)。
2.第二步：抗體特異性初篩（篩選分泌目標(biāo)抗體的雜交瘤）
當(dāng)雜交瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中形成肉眼可見(jiàn)的單克隆集落后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用與目標(biāo)抗體應(yīng)用場(chǎng)景匹配的檢測(cè)方法進(jìn)行初篩，核心是驗(yàn)證上清液中是否存在能與靶抗原結(jié)合的抗體。
常用初篩方法及適用場(chǎng)景：
ELISA：最常用的初篩方法，操作簡(jiǎn)單、通量高，適合檢測(cè)可溶性抗原或包被抗原的抗體，能快速篩選出陽(yáng)性克隆。
間接免疫熒光（IFA）：適合檢測(cè)細(xì)胞表面抗原或細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體，可直觀判斷抗體的結(jié)合特異性和定位。
Western Blot（WB）：適合檢測(cè)針對(duì)變性抗原表位的抗體，能驗(yàn)證抗體與靶蛋白的特異性結(jié)合，避免針對(duì)構(gòu)象表位的假陽(yáng)性。
流式細(xì)胞術(shù)（FCM）：適合檢測(cè)細(xì)胞膜表面抗原的抗體，靈敏度高，適合微量抗體的檢測(cè)。
3.第三步：抗體性能復(fù)篩（篩選高特異性、高親和力的陽(yáng)性克?。?/span>
初篩得到的陽(yáng)性克隆可能存在抗體親和力低、交叉反應(yīng)強(qiáng)的問(wèn)題，需要進(jìn)一步復(fù)篩，剔除假陽(yáng)性和低性能克隆，復(fù)篩的核心是嚴(yán)格驗(yàn)證抗體的特異性和親和力：
特異性驗(yàn)證：用與靶抗原有同源性的蛋白或無(wú)關(guān)抗原進(jìn)行交叉反應(yīng)測(cè)試，只有不與無(wú)關(guān)抗原結(jié)合的克隆才保留。
親和力驗(yàn)證：通過(guò)ELISA法測(cè)定抗體的效價(jià)（稀釋倍數(shù)），效價(jià)越高代表抗體親和力越強(qiáng)；也可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)判斷抗體與抗原的結(jié)合強(qiáng)度。
匹配應(yīng)用場(chǎng)景驗(yàn)證：如果抗體用于免疫組化（IHC），需用組織切片驗(yàn)證抗體的染色效果；用于免疫沉淀（IP），需驗(yàn)證抗體的沉淀效率，確保篩選出的克隆符合實(shí)際應(yīng)用需求。
二、保證陽(yáng)性克隆具有穩(wěn)定抗體分泌能力的關(guān)鍵措施
雜交瘤細(xì)胞在傳代過(guò)程中可能發(fā)生染色體丟失，導(dǎo)致抗體分泌能力下降甚至喪失，因此需要通過(guò)以下步驟保障穩(wěn)定性：
1.及時(shí)進(jìn)行亞克隆化培養(yǎng)（核心措施）
初篩和復(fù)篩得到的陽(yáng)性克隆，大概率是多個(gè)雜交瘤細(xì)胞形成的混合集落，需要通過(guò)有限稀釋法或軟瓊脂克隆法進(jìn)行亞克隆，目的是獲得單克隆細(xì)胞株：
有限稀釋法：將陽(yáng)性克隆細(xì)胞懸液梯度稀釋?zhuān)臃N到96孔板中，使每孔只含有1個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)后形成單克隆集落，再次檢測(cè)上清液的抗體分泌情況，保留陽(yáng)性單克隆。
該步驟需重復(fù)2~3次，確保最終得到的克隆是真正的單克隆，避免因多克隆混合導(dǎo)致的后續(xù)分泌不穩(wěn)定。
2.進(jìn)行長(zhǎng)期傳代穩(wěn)定性驗(yàn)證
將亞克隆得到的單克隆細(xì)胞株連續(xù)傳代10~20代，每代都檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的抗體效價(jià)：
如果傳代過(guò)程中抗體效價(jià)保持穩(wěn)定，說(shuō)明該克隆的染色體穩(wěn)定，抗體分泌能力可靠。
如果效價(jià)逐漸下降，說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生了染色體丟失，需淘汰該克隆，重新選擇亞克隆中的其他陽(yáng)性株。
3.優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件，避免細(xì)胞應(yīng)激
采用無(wú)血清培養(yǎng)基或低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，減少血清中雜蛋白的干擾，同時(shí)維持細(xì)胞的穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)。
控制細(xì)胞傳代密度，避免細(xì)胞過(guò)度密集或過(guò)度稀疏，防止細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)不足或接觸抑制導(dǎo)致?tīng)顟B(tài)變差。
培養(yǎng)過(guò)程中避免頻繁更換培養(yǎng)基或調(diào)整培養(yǎng)條件，減少細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。
4.及時(shí)凍存陽(yáng)性克隆，備份細(xì)胞株
篩選得到穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞株后，需及時(shí)凍存：
凍存時(shí)采用凍存液（培養(yǎng)基+10%DMSO+20%胎牛血清），程序降溫后放入液氮中保存。
凍存的細(xì)胞可作為種子庫(kù)，后續(xù)需要時(shí)復(fù)蘇，避免長(zhǎng)期傳代導(dǎo)致的抗體分泌能力衰退；復(fù)蘇后需再次驗(yàn)證抗體分泌能力，確保穩(wěn)定性。
